| 正文 脂质体是药物递送系统中一种常见的载体，具有良好的生物相容性和生物可降解性，许多基于脂质体的产品已被批准用于临床。 普通脂质体由单个或多个同心脂质双分子层组成，分为单层脂质体和多层脂质体，其中单层脂质体又可以分为小单层脂质体(SUV)和大单层脂质体(LUV)。 研究人员将内部含有多个囊泡的脂质体称为多囊系统(multivesicularsystems)［1］，多囊系统可以很好地解决普通脂质体包封体积小、水溶性药物载药量低、脂质膜一旦破裂药物便立即释放等问题。 本文对多囊系统的分类、结构特点、载药优势、制备方法以及在递药系统中的应用进行综述。 1 多囊系统的分类和结构特点 多囊系统根据其结构特点可以分为多囊脂质体(multivesicularliposomes，MVL)和多囊囊泡(multivesicularvesicles，MVV)2种类型。 MVL最早于1983年由Kim等提出，其是由非同心的脂质双分子囊泡紧密堆积而成的泡沫状球形聚集体［2］。 MVV于1997年由Zasadzinski等［3］提出，称其为囊泡体(vesosome)，也称多隔室脂质体(multicompartmentliposomes，MCL)或双脂质体(double-liposome，DL)，其特征为多个较小脂质体包封在较大脂质体中，形状接近球形。 MVL和MVV的具体结构如图1所示。 MVL和MVV结构上的共同特点在于其外部均由脂质双分子层构成，内部包裹多个水性囊状腔室，且各水性腔室之间通过脂质双分子膜相隔。 MVL和MVV结构上的主要区别是MVL的内部腔室之间相互交联并紧密堆积，而MVV的内部囊泡是分散的，并非紧密堆积。 MVL因含有以三酰甘油为代表的中性脂质而具有内部隔室紧密堆积的特点。 中性脂质是形成MVL的关键成分，填充于相邻水性腔室交汇处，可稳定MVL的膜骨架［4］。 MVL的内部水性腔室体积巨大，可占到整体体积的95%以上，因此特别适合包载水溶性药物［5］。 2 多囊系统的载药优势 MVL和MVV在结构上的特征，使其相对于普通脂质体在药物递送方面具有以下特点。 2.1 局部缓释的特征 MVL具有缓释长效作用。 一方面MVL因为有相对较大的粒径，经局部注射后，被淋巴系统和全身循环吸收的药量很小，所以MVL大部分停留在注射部位，形成药物贮库而实现药物的缓慢释放。 另一方面即使其中某一囊泡破裂，活性物质从破裂囊泡释放出来，然而完整的囊泡仍可保持原状。 由于各个囊泡破裂的时间不同，因此可延长药物的释放时间，达到缓释效果，缓释时间能持续数天甚至数周，从而减少注射次数，提高患者顺应性。 目前已有3个MVL制剂上市，分别是阿糖胞苷多囊脂质体(DepoCyt®，SkyePharma公司)、硫酸吗啡多囊脂质体(DepoDur®，SkyePharma公司)、布比卡因多囊脂质体(Exparel®，Pacira公司)。 鞘内注射DepoCyt®有助于靶向脑膜，最大限度地减少阿糖胞苷的全身分布，降低毒性。 给药频率从每周2次减少到每2周1次并可改善疗效。 DepoDur®的使用减少了控制术后疼痛所需止痛剂量。 与硬膜外给予游离吗啡或静脉注射阿片类药物相比，它在术后1～2d内可以提供更好的疼痛控制［7］。 Pacira公司于2018年4月宣布，FDA已批准产品Exparel®扩大其使用范围，包括通过肌间沟臂丛神经阻滞给药以产生术后局部镇痛。 Exparel®成为第1个用于接受上肢手术(例如全肩关节成形术或肩袖修复术)患者的神经阻滞长效单剂量制剂。 MVV同样具有良好的缓释长效作用，与单层脂质体相比，单个囊泡的破裂不会导致内部囊泡包封的药物完全释放，而且由于粒径足够大不能进入毛细血管，只能留在给药部位持续释放药物，使其成为局部给药的理想载体。 据报道在血清中，环丙沙星单层脂质体的保留时间小于10min，MVV的保留时间可增加至6h，即使在37℃血清中孵育10hMVV中仍保留超过40%的药物［8］。 并且MVV外部脂质双分子层可以通过修饰实现多功能化，同时可以根据对外部刺激如pH、氧化还原电位、渗透压、温度的响应以选择性地触发内部囊泡使单个囊泡释放药物，从而更有效地控制药物释放［9］。 2.2 载药量大 多囊系统内部含有大量水性腔室，比普通脂质体稳定性高、包封体积大、泄漏率低，特别适合包封水溶性小分子药物以及蛋白质、多肽类药物［4］，也为包封更多的脂溶性药物提供可能［10］。 2.3 MVV的独特优势 MVV的独特结构使其具有良好的载药优势。 MVV可以递送多种药物，实现联合治疗。 由于MVV内部具有多个隔室，可以将不同药物隔离，特别是具有不同物理性质如电荷、极性、相对分子质量的药物，避免包载在单个载体内产生共沉淀，同时可以改善疗效。 此外，MVV具有保护内囊的作用。 因为脂质体包裹脂质体的结构使内部隔室和外部环境之间形成物理屏障，所以在生理条件下，能够保护内部囊泡免于降解，避免药物突释。 Zasadzinski等已经证明，外部双分子膜形成的囊泡可以保护内部的载药隔室免受血液成分的侵害并可以减缓囊泡内容物的释放［11］。 Paleos等［12］研究表明对于用生物素修饰内部囊泡后的MVV，外膜能够保护内部囊泡不与链霉亲和素结合。 3 多囊系统的制备方法 多囊系统的制备方法较多，由于其结构的特殊性，复乳法是目前报道制备MVL的主要方法。 相比MVL，文献中报道了多种MVV的制备方法，包括Ca2+-EDTA诱导法、交叉融合法、微流体法、玻璃珠法以及玻璃膜过滤法等方法，详述如下。 3.1 MVL的制备方法 制备MVL的主要方法是复乳法，其制备工艺流程图如图2所示［13］。 具体步骤如下:先将多种脂质成分溶解于易挥发的有机溶剂形成油相，有机溶剂可以是二氯甲烷、氯仿、氯仿-乙醚的混合溶剂等，所用脂质通常包括一种负电荷磷脂、两性磷脂、中性脂质(常用三酰甘油)以及胆固醇。 选择合适的油水体积比将含药的水溶液(内水相)与油相混合，在室温下可通过超声、高速剪切分散、涡旋混合、喷嘴雾化等方法制备W/O型初乳。 然后将初乳迅速加入一定体积的等渗外水相中，并在一定条件下涡旋或机械剪切再次乳化形成W/O/W型复乳(油性腔室内含有多个水性腔室)。 将复乳转移至一定体积的外水相中，在适宜的温度下除去有机溶剂。 通过离心浓缩并除去游离药物，再用适于储存和生理上可接受的盐溶液(如0．9%NaCl溶液)洗涤置换外水相，最后调整药物含量并灌装，即获得MVL［4］。 MVL制备技术发展得较为成熟，已由英国SkyePharma公司开发为DepoFoam技术平台。 工业上可放大生产的制备工艺在CN104959087B中进行了详细描述［14］。 3.2 MVV的制备方法 3.2.1 Ca2+-EDTA诱导法 首先将由带负电的二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)组成的单层脂质体融合形成连续的平面膜片，随后在Ca2+存在下螺旋折叠形成雪茄状圆柱体。 然后将预先制备的脂质体加入到这些圆柱形的分散体中，并加入螯合剂EDTA后，除去Ca2+，将圆柱体展开以包封小脂质体形成封闭脂质膜(图3)［8］。 3.2.2 交叉融合法 通过向多种中性饱和磷脂中加入乙醇，形成“交叉指形”双层相制备MVV，文献中将其称为交叉融合法(interdigitation-fusion，IF)。 首先添加乙醇，在相转变温度(Tm)以下，乙醇嵌入凝胶相二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)分子的头部基团中，导致尾部交叉，诱导囊泡融合形成亚稳相交叉指形脂质双层片材，交叉指形双层片材具有较大的刚性并抵抗弯曲形成封闭囊泡。 当温度升高到Tm以上时，片材变得柔软并且自发闭合形成囊泡。 在从双层片转变为封闭囊泡的过程中，这些交叉指形脂质膜可以同时包封载有药物的囊泡，从而形成MVV。 该过程是不可逆的，即在温度降到Tm以下时囊泡依然保持完整结构［8］。 该方法具有生物相容性，并且更简单高效，双层片可以在不破坏其他囊泡或化学敏感材料的条件下打开和关闭(图4)［15］。 囊泡的大小可以通过添加胆固醇和调节乙醇浓度来改变。 MVV的粒径分布约0．5～3μm。 MVV通过一定孔径的过滤器挤出后，其多囊结构仍然保留，如果使用0．22μm过滤器，就可制备无菌样品［12］。 经过多次挤出，可以获得内部含有50nm小脂质体的直径约为150nm的MVV，可用于体内循环。 如果包囊颗粒和未包囊颗粒之间的大小差异足够大，则可通过温和离心或沉降将其分开，以提高包封的整体效率。 以上2种方法制得的小脂质体在较大囊泡内的包封率可达到60%～70%。 虽然这2种方法可以包裹由不同脂质成分制备的内部脂质体，但外部囊泡的磷脂组成仅限于某些特定类型［6］。 Ca2+-EDTA诱导法只能选择某些带负电的磷脂;交叉融合法不适用于含有顺式双键而具有永久“扭结”酰基链的磷脂，如二油酰基卵磷脂(DOPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)或蛋黄卵磷脂(EPC)，仅适用于可形成交叉指形双分子层的带有完全饱和酰基链的磷脂酰胆碱如DPPC和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。 DPPC或DSPC制备的IF囊泡具有较高的内部体积(＞20μL·μmol－1)。 除了纯DPPC之外，可以增加囊泡空间稳定性的聚合物脂质(如PEG-2000DPPE)也可以并入交叉指形片材用于包封囊泡。 此外，由于需要将温度升高到饱和磷脂的Tm以上(通常＞45℃)，因此不适合于对热不稳定的药物。 冷冻断裂透射电子显微镜证实在4℃贮存1个月后内部囊泡的稳定性良好［8］。 3.2.3 微流体法 将分散在水相(W1)中预先形成的单个脂质体作为内相重新注入微流体装置中以制备更大的W/O/W乳滴。 通过这种方法，较小的脂质体可以成功地装载到复乳的内部液滴中。 W1/O/W2复乳体系的界面能自发降低引起油相从复乳体系中分离。 随着油相中的氯仿挥发，较大的复乳液滴的油相逐渐分离，形成囊泡体和含有过量脂质的油滴，所得的囊泡体是均匀的，其内部囊泡和外部囊泡的平均粒径分别为43和102μm。 该微流体方法可以控制囊泡的粒径和结构。 内部囊泡的数量可以通过调节流速来改变。 例如，固定油相和外水相的流速分别为300和2500μL·h－1，并将内相流速从150，280μL·h－1增加到360μL·h－1，可以制备内部主要含有1～4个囊泡的MVV。 此外，通过减小外水相的流速，还可制备内部封装3～5个囊泡的MVV。 微流控技术具有相当大的灵活性，已经可以包封多个不同液滴。 更新后的微流体装置有2个独立的入口，可以包封不同的囊泡。 同样，这些乳剂完全去除溶剂后可以产生含有不同囊泡的MVV。 收集并分析300多个MVV颗粒，显示32%和22%的MVV分别含有2个和3个内部囊泡，同时还存在空的或内部含有1个或多于4个囊泡的MVV。 该方法可以扩展到制备更复杂的MVV(图5)［11］。 Nuti等［16］介绍了一种用于产生多囊液滴（MVDs)的微流体装置，可以用来制备MVV。 研究人员使用一种全氟化载体，该载体具有生物相容的表面活性剂，可产生含有巨单层脂质体的单分散悬浮液滴。 MVDs的制备通过高速显微镜得到了验证。 其中脂质囊泡和液滴的完整性可保存15min。 通过高速显微镜可以观察封装过程并可以调整脂质体悬浮液的浓度获得内部含有不同数量囊泡的MVV。 随着脂质体悬浮液的浓度由低到高，每个液滴的囊泡数量也随之增加，并且囊泡可以在不融合的情况下填充整个液滴。 3.2.4 玻璃珠法 Jain等［10］将多种脂质成分溶于氯仿，再将药物溶于少量乙醇中，并将2种溶液混合。 将所得溶液转移到含有玻璃珠(0．350～0．500mm)的圆底烧瓶中。 在室温下去除有机溶剂以在玻璃珠上形成含药的脂质膜。 将该膜用预先制备的内部脂质体悬浮液轻轻振荡10min进行水合得到MVV(图6)［10］。 Bolinger等也报道了使用预先制备的脂质体悬浮液水合干燥的脂质膜制备MVV。 据报道，制备的MVV的粒径范围为1～10μm，内部囊泡为100nm［8］。 3.2.5 玻璃膜过滤法 由Katayama等［17］提出的玻璃膜过滤法是一种新型的用于制备MVV的方法。 首先将脂质成分溶解在容易挥发的有机溶剂中，将药物溶解在少量乙醇中并倒入脂质溶液。 将该混合物渗入G4玻璃过滤器(孔径10～16μm)，并在室温下用温和的氮气流去除氯仿。 在玻璃滤器上形成的脂质层用特定缓冲盐溶液水化10min，并将玻璃滤器浸入水浴中，在60℃下超声处理30min，然后使一定量缓冲溶液通过交替按压滤器两侧的注射器反复通过滤器以形成脂质体。 将使用G4过滤器制备的脂质体悬浮液过滤到涂有类似脂质层包被的G3过滤器(孔径40～100μm)中来制备MVV。 使用G4滤器制备的脂质体的粒径为0．8～2μm，使用G3滤器制备的MVV的粒径为5～10μm。 这些结果表明脂质体的粒径取决于玻璃过滤器的孔径。 有必要使用N2对G4过滤器加压，因为使用G4过滤器超出了使用注射器压缩的范围。 如果可以开发高压设备，则可以使用孔径较小的过滤器来制备粒径在纳米范围内的脂质体。 用这种方法制备的MVV具有足够的大小和体外稳定性(图7)［17］。 4 多囊系统在药物递送中的应用 多囊系统主要用于局部缓释注射使用，但也有研究将其制成口服制剂或黏膜给药制剂。 4.1 MVL的应用 MVL主要用于局部注射，其既可以包载水溶性药物，也可以携带脂溶性药物。 4.1.1 水溶性药物 Zhang等［18］制备了皮下注射利拉鲁肽的多囊脂质体(Lrg-MVL)用于治疗糖尿病的持续释放药物递送系统。 单次皮下注射具有糖尿病的SD大鼠后，结果表明Lrg-MVL能够在治疗范围内保持恒定的药物水平超过144h，发挥持续降糖作用且没有任何突释。 药动学参数显示血药浓度Cmax为 (81.979±12.140)pg·m－1，MＲT0－t为(88.224±3.893)h。 在这项研究中，Lrg-MVL的相对生物利用度是普通注射剂的4倍以上，表明MVL具有保护利拉鲁肽免受DPP-IV或皮下组织中其他非特异性酶降解的能力。 张景勍等［19］用透明质酸(HA)修饰尿酸酶多囊脂质体(UHMVL)。 UHMVL经HA修饰以后，在降低尿酸水平的同时靶向透明质酸受体CD44和CD168，具有保护关节和抗炎双重作用。 在相同条件下，UHMVL不仅能提高尿酸酶的活性，还可以增强尿酸酶的血浆稳定性，在37℃血浆中尿酸酶保留50%初始活性的时间约为8.53h，而UHMVL保留50%初始活性的时间约为35.41h。 UHMVL在大鼠体内降低血尿酸水平的能力优于游离尿酸酶。 何盛江等［20］制备了PEG修饰的曲马多缓释多囊脂质体(TＲ-MVL)。 TＲ-MVL的体外释药符合一级释药规律，释药时间为72h，比逆相蒸发法制备的曲马多普通脂质体延长16.95倍。 研究表明药物从MVL中的释放不是简单扩散机制，而是通过囊泡的破裂这种近似球状表面溶蚀和扩散机制来释放药物。 研究观察了TＲ-MVL在释放过程中的形态变化，TＲ-MVL由原来的囊泡聚集体形态逐渐分散解体，大的囊泡破裂或融合，粒径变小，在释放末期还出现大量游离的单个小囊泡。 研究还发现TＲ-MVL的释放速度与双分子膜的稳定性、粒径、透析介质pH值、内水相渗透压等有关。 4.1.2 脂溶性药物 MVL由于其结构性质和较大含水内腔而被广泛用于包封水溶性药物。 Vafaei等［21］通过结合环糊精包合物(CD-IC)和MVL的优点，制备了脂溶性药物氟轻松丙酮(fluocinoloneacetonide，FA)的新型药物递送系统，以研究MVL在脂溶性药物中的潜在应用。 CD包含疏水性内腔可用于包载脂溶性药物，其亲水性外壳可以适应脂质体的水性腔室。 通过与几种CD形成包合物来增加FA的水溶性，并随后通过逆相蒸发法将FA-CD-IC包入MVL中。 CD的类型和比例在包封率和释放性质中起重要作用。 用药物与羟丙基-β-环糊精(HPβCD)的包合物制备的MVL具有适合的载药量，并在180h内持续释药。 药物通过扩散和侵蚀机制从MVL释放，释放模式符合一阶方程。 包载有α-CD的MVL与包载有β-CD和HPβCD的MVL相比药物释放更快，可能是由于α-CD易与MVL的磷脂双分子层相互作用，导致药物从囊泡中部分泄漏。 Luo等［22］将脂溶性药物齐墩果酸(OA)加入油相中制备MVL制剂。 结果表明OA-MVL为球形颗粒，平均粒径为11．57μm，包封率为(82．3±0．61)%。 OA-MVL在体外缓释模式符合Ｒitger-Peppas方程;OA-MVL与OA溶液相比显示出更长的体内循环时间;经MTT和荧光显微镜检测证实OA-MVL抑制人肝癌细胞HepG2的生长;用H22荷瘤小鼠进行的体内研究表明，OA-MVL显示比OA溶液更强的抗肿瘤作用。 研究表明MVL不仅可以包封水溶性药物，而且可以高效地携带脂溶性药物，为难溶性药物提供新的策略。 此外，多种类型的在研药物也试图采用该技术实现缓释给药，如止血剂［23］、抗胆碱酯酶药［24］、局部麻醉剂［25］、生物碱类药物［26－27］等。 4.2 MVV的应用 4.2.1 局部注射给药 Cohen等［28］研究了一种包载有布比卡因的MVV(Bupisome)，可作为超长效局部麻醉剂使用。 通过与相同脂质成分的SUV比较，Bupisome的包封体积是其21倍，药脂比和SUV相比高10倍。 低温透射电子显微镜显示MVV内没有布比卡因晶体。 通过DSC研究表明药物与脂质体膜相互作用。 Bupisome已被证明是延长镇痛时间的有效手段，其t1/2大于40h，高于已经上市的布比卡因多囊脂质体制剂Exparel®(用于子宫切除术t1/2为24h、用于痔切除术t1/2为34h)。 MVV在给药部位的滞留时间延长以及药物从脂质体储库缓慢释放可降低血浆峰值水平，从而降低人体的毒副作用。 这提示可以给予更高(＞4倍)的布比卡因用于治疗手术或创伤后急性疼痛［29］。 Da等［30］研究了一种罗哌卡因(ＲVC)脂质体组合系统，该系统由含有ＲVC和(NH4)2SO4的供体MVV以及内部pH为5．5的受体LUV2种类型的脂质体组成。 由供体MVV包封的带电ＲVC缓慢去离子并跨膜以分子形式存在于溶液中;受体LUV能够捕获溶液中的一部分ＲVC，其内部酸性pH有利于药物发生解离并保留在其中，导致药物长时间滞留在作用部位。 由2种具有跨膜离子梯度的囊泡组成的脂质体系统克服了常规脂质体包封率低和局部麻醉剂快速释放的缺点，并有效地将离子化的ＲVC滞留在囊泡内，确保了麻醉剂的持续释放。 体外释放实验表明，与常规脂质体(45h)或游离ＲVC(4h)相比，脂质体组合系统提供了显著增长的ＲVC释放(72h)。 含有2%ＲVC的组合制剂在小鼠皮下浸润后，麻醉持续时间延长至9h。 4.2.2 口服给药 Jain等［10］通过逆相蒸发法制备了含有枸橼酸铋雷尼替丁(ＲBC)的内部囊泡;通过玻璃珠法制备了MVV，其外部囊泡载有阿莫西林三水合物(AMOX)，该制剂可以有效控制黏膜溃疡。 在体外释放144h后，显示AMOX和ＲBC的累积释放率分别为(93．6±1．9)%和(84．1±0．9)%。 与普通药物组合相比，MVV显示出更高的幽门螺杆菌生长抑制率;体内研究显示MVV的抗分泌和溃疡保护活性增强。 MVV有助于减少胃分泌物、具有靶向溃疡部位、减小不良反应的优点。 Catalan-Latorre等［31］研究了一种能够改善姜黄素口服给药后生物利用度的新型囊泡型制剂。 该研究在MVV的制备中加入了Eudragit®S100，用于保护囊泡免受胃酸pH的影响，并将其与透明质酸结合以固定磷脂结构，增加姜黄素在胃肠道中的稳定性。 冷冻干燥的样品再水化后发现囊泡粒径减小并具有良好的均匀性。 通过cryo-TEM发现，囊泡的粒径和形状不规则，呈球形或椭圆形，具有独特的多囊结构，其中包含1～4个较小的囊泡。 体外研究发现与游离药物相比，该制剂具有更大的姜黄素肠沉积，证实Eudragit-透明质酸可以保护囊泡免受胃肠道离子强度和pH变化的影响。 4.2.3 其他 此外，不限于脂质材料，已经研究了类似于MVV的多隔室聚合物组装体(polymersomein-polymersome)［8］。 这种多室系统有望成为药物递送载体，并且可以设计不同的聚合物囊泡，使其能响应不同化学或环境刺激而在特定条件下释放药物。 基于MVV的结构，研究人员制备了包含树状分子-siＲNA复合物的脂质体—树状体(dendrosome)。 相比磷脂，树状体的粒径更小且更容易调整。 对于MVV，药物被封装在小脂质体的水性腔室内，而药物与树状体存在共价和非共价连接的可能性，具有更高的柔韧性(图8)［6］。 5 展望 多囊系统因其特有的结构和特点，具有良好的储库及缓释作用，成为国内外众多学者研究的重点。 目前，MVL的发展较为成熟，已有工业化生产并有产品上市。 但MVL的研究仍存在一些问题:如在贮存过程中易出现聚集、药物泄漏、磷脂氧化等稳定性问题;不适合静脉注射给药;不能采用过滤灭菌等。 因此需要进一步深入研究MVL结构的影响因素及制备工艺，进一步扩大其应用范围。 MVV的研究则相对滞后，但其在递送不相容的生物活性化合物并可以通过级联释放递送多种药物方面具有独特的优势，有望成为联合治疗的新载体;也可以将药物和显像剂包封在不同的囊泡中，使其能够在患病组织中成像并监测药物递送动力学。 目前MVV的制备技术仍有许多问题有待解决，特别是控制内部脂质囊泡的大小、层状度和负载量。 随着研究的深入及相应技术的成熟，如微流体技术可以设定内部囊泡占用率，有利于精确递送药物。 MVV作为递药载体在未来会具有良好的应用前景。 |
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